GLP-1(koppeling:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) is een polypeptidehormoon bestaande uit 30 aminozuren. Met het diepgaande onderzoek naar GLP-1 zijn er steeds meer synthetische methoden ontwikkeld. Dit artikel introduceert systematisch de momenteel bekende synthesemethoden van GLP-1.
Methode 1, synthese in vaste fase:
Vaste-fasesynthese is een veelgebruikte methode voor peptide- en eiwitsynthese en wordt ook vaak gebruikt voor de synthese van GLP-1. Bij synthese in de vaste fase wordt de kernstructuur gevormd door het eerste aminozuur aan de hars te koppelen. Vervolgens wordt het volgende aminozuur achtereenvolgens toegevoegd en chemisch gereageerd met een geschikt condensatiemiddel. Ten slotte kan het doelproduct worden verkregen door het polypeptide van de hars te splitsen.
Het belang van vastefasesynthese is dat het de automatisering en grootschalige productie van peptidesynthese mogelijk maakt. De huidige reguliere methoden voor vaste-fasesynthese omvatten Fmoc en Boc. Onder hen gebruikt de Fmoc-methode de N-Fmoc-beschermende groep om het peptide te beschermen, terwijl de Boc-methode tert-butyloxycarbonyl gebruikt om de carboxylgroep te beschermen.
Methode twee, synthese in vloeibare fase:
Vloeistoffasesynthese is een traditionele methode van peptidesynthese waarbij de reagentia voor de reactie in de vloeibare fase worden geplaatst. Het voordeel van vloeistoffasesynthese is dat de reactieomstandigheden mild zijn en geschikt voor de modificatie van gevoelige chemische structuren. Vanwege te veel reactanten is het zuiveringsproces echter relatief omslachtig. Chemische reacties bij synthese in vloeibare fase zijn onder meer:
1. Condensatiereactie:
Condensatiereactie is een van de meest basale reacties bij peptidesynthese, dat wil zeggen dat de carboxylgroep die wordt geïnitieerd door condensatiemiddelen zoals DCC en HOBt, is verbonden met de aminogroep van het aminozuur door middel van een acyleringsreactie. De reactieomstandigheden zijn mild en de opbrengst is hoog.
2. Eliminatiereacties:
De eliminatiereactie is het reduceren van methionine tot dithiol door NaBH4 en andere reductiemiddelen, waardoor het inactief wordt. De reactie moet worden uitgevoerd onder basische omstandigheden.
3. Verwijdering van beschermende groepen:
Vanwege de verschillende functies van aminozuren in de peptideketen, zullen verschillende beschermende groepen worden gebruikt voor bescherming. Nadat de synthese is voltooid, moet de beschermende groep worden verwijderd. Voor de Fmoc-methode wordt gewoonlijk piperidine gebruikt om Fmoc te verwijderen; terwijl voor de Boc-methode TFA wordt gebruikt om Boc te verwijderen.
Methode drie, chemische synthese:
GLP-1 is een polypeptidehormoon met belangrijke biologische activiteiten. De synthese ervan kan op verschillende manieren worden gerealiseerd, waaronder chemische synthese een van de meest gebruikte methoden is. Het voordeel van chemische synthese is dat het zeer zuivere doelproducten kan opleveren, die geschikt zijn voor productie op grote schaal. De chemische synthesemethode en gedetailleerde stappen van GLP-1 worden hieronder geïntroduceerd.
1. Synthetische route en selectie van beveiligingsgroepen:
Het GLP-1-molecuul bestaat uit 36 aminozuren, waaronder 21 L-type en 15 D-type aminozuren. Alvorens de synthese uit te voeren, is het noodzakelijk om een geschikte synthetische route te selecteren en de overeenkomstige beschermende groep te selecteren volgens de synthetische omstandigheden. Fmoc-vastefasesynthese wordt meestal gebruikt voor geautomatiseerde grootschalige synthese. Deze methode gebruikt N-9-fluoroimidocarboxylbescherming (N-Fmoc) als een beschermende groep en moet ook een geschikte secundaire beschermende groep selecteren (zoals tert-butyl of methyl) om de bescherming van specifieke locaties te waarborgen. Elke keer dat een nieuw aminozuur wordt toegevoegd, moet eerst de Fmoc-beschermende groep worden verwijderd en vervolgens wordt de beschermde koppelingsstof van het volgende aminozuur toegevoegd.
2. Synthese van de belangrijkste aminozuursequentie:
De kernsequentie van GLP-1 bestaat uit 21 aminozuren, waaronder een belangrijke serine- en vier prolyl-glutaminezuur-dipeptidesequenties. Bij synthese in vaste fase kan de synthese van de kernsequentie worden onderverdeeld in de volgende stappen:
2.1. Voeg azijnzuurcarbamaat (Fmoc-NH-CH2CO2Et) en 2-Cl-Trt-Cl toe aan synthetische hars in vaste fase en voer een condensatiereactie uit met DIC/NMM-koppelingsmiddel.
2.2. Verwijder de Fmoc-beschermgroep door de groepsreactie op te heffen.
2.3. Voeg het volgende aminozuur toe, herhaal stap 1 en stap 2 in volgorde totdat de kernsequentie is gesynthetiseerd.
2.4. Vorming van pentapeptidestructuren op hars in vaste fase. Voeg het acetaliseringsreagens toe aan de hars in vaste fase, reageer met het N-terminale herkenningsmiddel (zoals HBTU), voeg de zijketenbeschermingsgroep van serine toe als een hulpreductiemiddel en verwijder vervolgens de Fmoc-beschermingsgroep.
2.5. Onder de katalyse van Bacillus subtilis transferase (ProTide), ondergaat de pentapeptidestructuur een uitwisselingsreactie met de voorloper van serine-joodacetaat.
3. Synthese van de resterende aminozuursequentie:
Na het voltooien van de synthese van de kernsequentie, is het noodzakelijk om door te gaan met het toevoegen van de resterende aminozuren, inclusief L- en D-type aminozuren. De toevoeging van deze aminozuren moet beginnen bij de kernsequentie, het volgende aminozuur in de juiste volgorde toevoegen en het overeenkomstige condensatiemiddel gebruiken om chemische reacties uit te voeren totdat een compleet GLP-1-polypeptidemolecuul is gesynthetiseerd. Tijdens dit proces is het ook nodig om naar behoefte een geschikte beschermende groep te kiezen en de stappen van reactie, verwijdering van de beschermende groep en toevoeging van aminozuur achtereenvolgens uit te voeren.
4. Behandeling met natriumhydroxide:
Nadat alle aminozuren zijn toegevoegd, wordt een onvolledig gesynthetiseerde peptideketen gevormd op de vaste-fasehars en moet deze worden verwerkt om een volledig gevormd peptidemolecuul te vormen. Ten eerste moet het ongevormde peptide worden gehydrolyseerd door natriumhydroxide, zodat de C-terminale carboxylgroep die oorspronkelijk aan de hars was gehecht, wordt losgemaakt van de hars en de beschermende groep wordt losgemaakt in water. Na de hydrolysereactie wordt het doelproduct verkregen.
5. Neerslag en wassen:
Na de behandeling wordt de gehydrolyseerde oplossing behandeld met zuur om het doelproduct neer te slaan. Vervolgens werd de pellet geresuspendeerd in water, gevolgd door intensief wassen om onzuiverheden te verwijderen.
6. Zuivering:
De laatste stap is de zuivering van het gewenste product, meestal met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie. Tijdens dit proces kan de zuiverheid van het product worden bepaald door de piek van de oplossing in het massaspectrum te detecteren. Kortom, de chemische synthese van GLP-1 vereist meerdere rondes van complexe reacties en strikte zuiveringsprocessen om uiteindelijk het actieve doelproduct te verkrijgen.
Methode vier, biosynthese:
GLP-1 is een belangrijk polypeptidehormoon met verschillende fysiologische effecten, waaronder het bevorderen van de insulinesecretie, het onderdrukken van de eetlust, het verminderen van het lichaamsgewicht en het behouden van de insulinegevoeligheid, enz. De biosynthesemethode van GLP-1 wordt voornamelijk gesynthetiseerd door L-cellen in de alvleesklier, en de synthesesnelheid wordt gereguleerd door de inname via de voeding. De gedetailleerde stappen worden als volgt geïntroduceerd:
1. Voorbereidend werk vóór synthese:
Voorafgaand aan de biosynthese van GLP-1 moet er wat voorbereidend werk worden gedaan, waaronder het bepalen van het gebruikte celtype, het instellen van de kweekomstandigheden en het selecteren van het juiste katalytische enzym. L-cellen zijn de belangrijkste bron van GLP-1-synthese omdat ze voorlopers bevatten van twee hormonen, GIP (glucagon-like peptide 1) en GLP-1. L-cellen kunnen worden geïsoleerd uit het darmepitheel van konijnen of muizen. Vóór de biosynthese moeten er voldoende cellen worden gekweekt en moeten er voldoende voedingsstoffen en geschikte kweekomstandigheden worden geboden. Bovendien is het noodzakelijk om het geschikte katalytische enzym te selecteren om de reactie te bevorderen.
2. Synthese en verwerking van voorlopers:
De biosynthese van GLP-1 vindt voornamelijk plaats in L-cellen en de voorloper ervan bestaat uit twee hormonen, GIP en GLP-1. Nadat ze de endocriene cellen zijn binnengegaan, worden GIP en GLP-1 verwerkt door proteolytische enzymen en gesplitst in afzonderlijke peptiden. Bij dit proces is een reeks enzymen en cofactoren betrokken, waaronder precursor-polypeptide-acidase (PC2), isomerase en late adhesiefactoren.
3. Wederzijdse conversie tussen polypeptidesegmenten:
Na verwerking worden de GIP- en GLP-1-peptiden opnieuw gecombineerd om het GLP-1-polypeptide te vormen. Dit proces vereist het gebruik van glucagonachtig peptide 1 (GLP-1) als een sjabloon waarop andere individuele peptiden worden gecombineerd om nieuwe samengestelde polypeptiden te vormen. Dit proces vereist ook enkele specifieke enzymen en factoren, waaronder Prohormone Convertase 1/3 (PC1/3) en Carboxypeptidase E (CPE).
4. GLP-1-secretie:
Nadat GLP-1 is gesynthetiseerd en verwerkt, wordt het opgeslagen in het cytoplasma en de interne blaasjes van endocriene cellen. Wanneer gestimuleerd door een dieet, geven endocriene cellen GLP af-1 en komen ze in de bloedcirculatie via microvaatjes. Dit proces wordt gereguleerd en gecontroleerd via een reeks signaaltransductieroutes, waaronder cAMP-Ca2 plusenzovoort.
Kortom, de biosynthese van GLP-1 omvat de gezamenlijke actie van meerdere links en factoren. De combinatie van biosynthese en chemische synthese kan een betere basis en ondersteuning bieden voor het onderzoek naar en de productie van GLP-1.
Methode vijf, enzymatische synthese:
Enzymatische synthese is de synthese van peptideketens door de katalyse van biologische enzymen. Vergeleken met traditionele vloeistoffasesynthesemethoden kan enzymatische synthese bij kamertemperatuur worden uitgevoerd en kan een breed scala aan grondstoffen worden geselecteerd. Enzymen zoals theta-liquid synthase, AEP, ACE, etc. worden meestal gebruikt om de synthese te katalyseren.
Concluderend, de bovengenoemde methoden zijn haalbare methoden voor GLP-1-synthese. Verschillende methoden zijn geschikt voor verschillende experimentele omstandigheden en farmaceutische productieomgevingen.